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动物细胞培养及胚胎培养培养基的要求  

2013-08-03 09:57:33|  分类: My边教边学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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动物细胞培养时对培养基的要求:

培养基按其来源可分为天然培养基和合成培养基。天然培养基的营养成分与细胞在体内所需条件比较接近,但就细胞在体外生存的环境来说,合成培养液也有其独特之处,譬如成分便于控制和标准化。体外培养的细胞直接生活于培养基中,无论何种培养基都应该能满足细胞生长所需的营养与生理的基本要求。

(1)    营养成分:

1)  氨基酸 合成培养液中的氨基酸以12种必需氨基酸为主,这些氨基酸不能由细胞自身合成,必需由培养液供给。在氨基酸的成分中 谷氨酰胺的作用特别重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,在配制各种培养液中应补加一定量的谷氨酰胺。

2)  单糖 葡萄糖是最常用和最好的单糖

3)  维生素 维生素在细胞代谢过程中必不可少,主要可以提供辅酶和辅基。生物素、叶酸、泛酸、核黄素、维生素B12等等

4)  其他成分:细胞生长过程中除需钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素外,还需要一些微量元素,如铁、锌、硒、铜、锰、钼等。此外,为优化细胞生存环境,合成培养基中有时还添加些其他成分,包括核酸降解物、抗氧化剂等。

2)促生长因子及激素

     各种激素、生长因子对于促进细胞生长、维持细胞功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。如胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸,泌乳素可促进乳腺上皮细胞生长的作用。各种生长调节因子的作用更加明显并具有特异性。

3pH

大多数细胞的适宜pH7.2-7.4,偏离此范围对细胞将产生有害影响。造成培养基pH波动的主要物质是细胞代谢产生的二氧化碳。解决这一问题可采取两种方法:一是用具有一定缓冲能力的培养基,如使用NaHCO3-CO2缓冲系统,二是采用开放式培养的方法,使细胞代谢产生的二氧化碳及时逸出培养皿。

4)渗透压

     细胞必须生活在等渗的环境中,大多数培养细胞对渗透压有一定的耐受性。

注:天然培养基主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。

   合成培养基是人工配制的培养基,给细胞提供一个近似体内生存的环境,又便于控制和标准化的体外生存环境,但合成培养基尚未成为十分完全的培养基。只能维持细胞不死,不能促进细胞增殖生长,使用时还需要添加一定比例的天然培养基(如小牛血清)。

 

早期胚胎的体外培养:

体外受精的早期胚胎在体外发育的中,往往会停止在某一阶段不再发育,这种现象称为:发育阻滞。此外体外培养环境下不能及时清除有害物质(如细胞内H2O2),不断积累也会造成细胞中毒,使胚胎阻滞。

发育阻滞是体外培养中的一个主要障碍,通过改进培养液成分和建立体细胞共同培养体系,在不少动物中已克服,使胚胎顺利发育到囊胚阶段。

1.       培养条件:

(1)       能量底物

胚胎培养液一般不含葡糖糖,代之以乳酸和丙酮酸为能量供应物。研究表明早期胚胎对葡萄糖的利用是有限的,而主要以乳酸和丙酮酸为能量代谢的底物,所以,培养液中低剂量葡萄糖的添加是必需的。

(2)       氨基酸

体外培养液中加入氨基酸有利于克服胚胎的发育阻滞,不仅能促进胚胎的早期发育,而且能增强其植入后的发育能力。

(3)       血清

 血清是胚胎培养中添加的主要的蛋白质源物质,在保持细胞的生存、促进生长、维持细胞酸碱度和渗透压的稳定等方面有重要作用。但血清的成分很复杂,包括生长因子、激素、维生素、矿物质、细胞因子以及其他一些还未确定的物质。

(4)       细胞因子

  自然情况下,不少细胞因子能促进胚胎发育,无血清培养液中加入细胞因子能促进胚胎发育,增强蛋白质的合成和囊胚的孵化。

(5)       抗氧化作用

   胚胎代谢过程中产生的反应氧能改变细胞内的一些分子,对胚胎的发育有阻滞效果。胚胎细胞内有一些抗氧化酶能起到抗氧化作用。次牛磺酸、牛磺酸以及维生素C对胚胎发挥外部抗氧化效应。

2.       体细胞共培养

将胚胎与某些类型的体细胞共同培养可以有效的克服发育阻滞,这些与胚胎共同培养的细胞称为饲养层细胞。饲养层细胞的作用可能与产生胚胎营养因子与抗培养环境中胚胎毒性物质有关。

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