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【转载】关于限制酶特异性的几个问题的分析  

2013-08-12 09:24:05|  分类: 引用参考 |  标签: |举报 |字号 订阅

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来源:《生物学通报》2013年3期  作者:陈卫东

       【摘要】关于限制酶特异性的问题,会有不少争议或误解,本文就几个争议问题进行了讨论和分析。

【关键词】限制酶  特异性  分析

 

关于限制性核酸内切酶(简称限制酶)的功能问题,是近几年高考的热点问题,也是难点问题。限制酶可分为三种,即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型酶。所有的限制酶都具有共同的特性,如它们只切割双链DNA分子,不切割单链DNA;每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性等。其中Ⅱ型酶在基因工程中应用最广泛,所以限制酶一般指的是Ⅱ型酶。

限制酶的作用是能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列,识别序列一般为4~6个碱基,也有8个碱基的。切割位点的DNA的两条单链上识别序列从5′端阅读时是完全一样的,这种结构叫做“回文”结构。每一种限制酶都有自己特定的作用位点,在特定的位点上把DNA切开。切割位点通常位于识别序列之内,切割使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。限制酶在切割DNA片段时,有些酶在两条识别序列的中间切割,形成所谓的齐头末尾(又叫平末端)。但大多数限制酶都交错切割识别位点,形成一条单链尾巴,这种结构叫做黏性末端。利用黏性末端可以特异性地将两条来源不同的DNA片段连接在一起,因为两条单链尾巴可以通过碱基互补配对及DNA连接酶的作用粘连在一起(前提是黏性末端的碱基可以完全互补配对)。

我们知道,限制酶具有特异性,但是关于限制酶的特异性,常会有以下几个疑问:

1.一种限制酶只能识别一种碱基序列吗?

一种限制酶通常只识别一种特定的碱基序列,但是有少数限制酶却可以识别不止一种碱基序列。如:AccⅠ识别的序列是—GT↓MKAC—(其中M代表A或C,K代表G或T),也就是说可识别4种序列(即—GTATAC—、—GTAGAC—、—GTCTAC—、—GTCGAC—)。HindⅡ能够识别的序列是—GTY↓RAC—(其中Y代表C或T,R代表A或G),也可以识别多种碱基序列。因此,并不是所有的限制酶都只能识别一种特定的碱基序列。

2.不同限制酶识别的碱基序列都不同吗?(或一种特定的碱基序列只能被一种限制酶识别吗?)

已知发现的限制酶种类要远超过能够识别的碱基序列,这是因为在很多情况下不同限制酶可以识别同一碱基序列,即存在“同裂酶”(或“同切点酶”、“异源同工酶”)。

虽然不同酶识别的碱基序列相同,但它们的切割位点可能不同。常见的有以下两种情况:

2.1同序同切酶:不同的限制酶识别的碱基序列和切割位置都相同,如HindⅡ与HincⅡ均识别切割位点—GTY↓RAC—,HpaⅡ与HapⅡ均识别切割位点—C↓CGG—,MobⅠ与Sau3AⅠ均识别切割位点—↓GATC—,AhaⅢ与DraⅠ均识别切割位点—TTT↓AAA—。

2.2同序异切酶:这些酶识别序列虽然相同,但切割位置不同,如KpnⅠ和Asp718Ⅰ识别的序列是相同的,均为—GGTACC—,但它们的切割位点不同,KpnⅠ切割的位点为—GGTAC↓C—,Asp718Ⅰ切割的位点则为—G↓GTACC—。

3.不同限制酶切出的末端都不能相互连接吗?

因不同限制酶切出的末端往往不同,所以会有此疑问。对于这个问题,我们也可以分为几种情况进行讨论分析:

3.1如切出的末端是黏性末端:

3.1.1同序同切酶:虽然限制酶不同,但识别的碱基序列相同,且切点也相同,它们切出的末端是可以相互连接的。

3.1.2同尾酶:来源不同,识别的碱基序列也不相同,但能切割产生相同末端的限制酶叫同尾酶。所有平末端酶产生的末端均是相同的,但一般不把它作为同尾酶来研究。因此同尾酶一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。

同尾酶中,识别序列不同的限制酶,虽然识别的碱基序列不同,但是切开的黏性末端的碱基却能够正好相互配对,在DNA连接酶的作用下能形成重组DNA分子,如:限制酶BamHⅠ识别的碱基序列为—G↓GATCC—,限制酶BglⅡ识别的碱基序列为—A ↓GATCT—,限制酶MboⅠ识别的碱基序列为—↓GATC—,限制酶BamHⅠ切开的DNA两条链的黏性末端中没有被配对的碱基是GATC—,限制酶BglⅡ和限制酶MboⅠ切开的黏性末端未配对的碱基也都是GATC—。通过比较不难发现这三种限制酶切得的黏性末端是可以相互配对连接的。

类似的情况还有不少,如限制酶SalⅠ与XhoⅠ,HpaⅡ与TaqⅠ等。

3.2平末端:平末端与黏性末端不同,由于不存在类似于黏性末端碱基互补配对的问题,因此不同的限制酶切开的平末端在DNA连接酶的作用下可以相互连接,形成重组DNA序列。

4.不同限制酶切开的末端如能重新连接,原有的限制酶是否还能再特异性识别并切开?

对于这个问题,还是应该分为几种情况去讨论:

4.1同序同切酶:虽然限制酶不同,但识别的碱基序列相同,且切点也相同,因此它们切出的末端重新连接后,又恢复到原有的碱基序列,这些序列还可以被这些同序同切酶再识别。

4.2同尾酶:同尾酶识别的靶序列不相同,但能切割产生相同的黏性末端,因此也可以通过碱基互补配对的形式重组。同尾酶重组后碱基序列与原有两种酶识别的碱基序列均不同,因此原有的限制酶均不再能够识别这种序列,也就不再能够重新切开。如BamHⅠ识别的序列是—G↓GATCC—,BglⅡ识别的序列是—A↓GATCT—,而BamHⅠ与BglⅡ切开后的片段重新连接(非自身连接)后的碱基序列是一条链是—AGATCC—,另一条链则为—GGATCT—,已经不是“回文”序列,无论是BamHⅠ还是BglⅡ都无法再识别,所以无法再把其切开。

4.3平末端:同样道理,如两种限制酶切开的都是平末端,而这两种限制酶不是同序同切酶,则两种末端虽然可以重组连接,但连接后的碱基序列与原有限制酶识别的序列不同,原有的限制酶也不再能够识别。

 

参考文献:

1.刘祖洞,遗传学,北京:高等教育出版社,1994年4月;

2.吴相钰、陈守良、葛明德,陈阅增普通生物学第三版,北京:高等教育出版社,2008年11月

3.刘庆昌,遗传学第二版,北京:科学出版社,2010年1月

4.杨业华,分子遗传学,北京:中国农业出版社,2000年11月

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