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如何从文库中提取出需要的基因?  

2013-04-03 11:23:51|  分类: My边教边学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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基因文库建成了,又如何从中提取出所需要的基因呢?常用的提取方法是分子杂交。首先把属于一个文库的细菌或噬菌体以较低的密度接种在固定培养基上。每个单独的细胞形成自己的后代(克隆)。然后将硝酸纤维薄膜授于培养皿上,吸印下细胞克隆,其位置和培养皿上完全对应。在这同时要制备供分子杂交用的探针,常采用的探针是用放射性元素标记的与待提取的DNA互补的DNA,即cDNAcDNA可通过两个途径获得。一是利用分离到的基因转录产物mRNA,借助反转录酶合成;二是在得不到mRNA的情况下,如果已知哪怕是基因的一部分结构(通过分析DNA的核普酸序列或分析由基因编码的质白质的一级结构)就可以合成一个基因的短片段。获得cDNA后,先进行切口平移:用DNAI处理,使cDNA造成单链缺口。然后在含有32P标记的核昔三磷酸的缓冲液中进行修补复制,制成带有放射性元素的探针。用NaCl分别处理探针DNA和滤膜上的菌落或噬菌体cDNA,使之变性,然后进行原位杂交。将滤膜覆盖在X光底片上进行放射自显影。在培养皿中找出和X光底片上的黑点相对应的菌落或噬菌斑。后者便包含着所要找的基因。再经过扩增以获得大量基因副本。

如果既不知道基因结构,也不知道由它编码的蛋白质结构,但知道是一种什么蛋白质。在这种情况下,就设法获得该蛋白质的抗体。该抗体只同产生它的抗原(即由要找的基因产生的蛋白质)互相作用,形成抗体一抗原复合体。若把放射性元素导入抗体,该抗体与带有不同基因片段的细菌或噬菌体克隆的产物—蛋白质作抗体一抗原反应。根据放射性标记就可以找到产生该抗原的基因,即需要提取的基因。(摘自《生物学通报》1991年第3期)

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